Système d’acquisition de l’hème

Table des matières

Résumé
Abstract
Table des matières
Liste des tableaux
Liste des figures
Liste des abréviations
Remerciements
Chapitre 1 : Introduction
1.1 Le fer est essentiel
1.2 Système d’acquisition de l’hème
1.2.1 Système d’acquisition direct de l’hème
1.2.2 Système d’acquisition de l’hème via un récepteur bipartite
1.2.3 Système d’acquisition de l’hème via un hémophore
1.2.4 L’hème dans le cytoplasme
1.3 Le regroupement des gènes chu
1.4 La protéine ChuS
1.5 La protéine ChuX
1.6 La protéine ChuY
1.7 La protéine ChuW
1.8 Objectifs spécifiques
Chapitre 2 : Matériel et Méthodes
2.1 Matériel
2.1.1 Vecteurs pour le clonage et la production des protéines
2.1.2 Principaux composés chimiques utilisés
2.1.3 Solutions
2.2 Amplification par PCR des gènes chuX, chuY et chuW
2.3 Clonage des gènes
2.3.1 Clonage des gènes chuX, chuY et chuW dans les vecteurs pASK-IBA
2.3.2 Clonage des gènes chuX et chuS dans le vecteur pET15b
2.4 Purification et séquençage des clones
2.5 Surexpression des protéines
2.5.1 Transformation par électroporation
2.5.2 Cultures bactériennes et induction de l’expression protéique
2.5.3 Extraction des protéines totales pour l’analyse d’expression
2.5.4 Bris de cellules pour la purification de protéines
2.5.5 Méthode de solubilisation en conditions dénaturantes de ChuW
2.6 Purification des protéines
2.6.1 Chromatographie d’affinité sur résine couplée à la streptavidine
2.6.2 Chromatographie d’affinité sur Ni2+-Sépharose
2.6.3 Dosage des protéines par la méthode de Bradford
2.6.4 Vérification de la pureté des protéines
2.7 Tamisage moléculaire
2.8 Reconstitution des protéines ChuS et ChuX avec de l’hème
2.8.1 Préparation d’une solution d’hémine
2.8.2 Préparation d’holo-ChuS
2.8.3 Préparation d’holo-ChuX
2.8.4 Dosage par la méthode du pyridine-hémochrome
2.9 Spectroscopie d’absorption
2.10 Cinétiques pré-stationnaires avec un mélangeur à flux arrêté
2.11 Extraction à la pyridine et spectre optique du complexe pyridine-verdohème
2.12 Dosage du fer
Chapitre 3 : Présentation des résultats
3.1 Amplification par PCR des gènes chuX, chuY et chuW
3.2 Clonage et séquençage des clones
3.3 Surexpression des protéines
3.3.1 Expression des protéines ChuXN-Strep et ChuXN-His
3.3.2 Expression de la protéine ChuYN-Strep
3.3.3 Expression des protéines ChuWN-Strep et ChuWC-Strep
3.4 Purification des protéines
3.4.1 Purification de la protéine ChuXN-Strep
3.4.2 Purification de la protéine ChuXN-His
3.4.3 Purification de la protéine ChuYN-Strep
3.4.4 Purification de la protéine ChuWN-Strep
3.4.5 Purification de la protéine ChuSN-His
3.5 Reconstitution des protéines avec de l’hème
3.5.1 Reconstitution de la protéine ChuXN-Strep avec de l’hème
3.5.2 Reconstitution de la protéine ChuSN-His avec de l’hème
3.6 Tamisage moléculaire
3.6.1 Tamisage moléculaire de la protéine ChuXN-Strep
3.6.2 Tamisage moléculaire de la protéine ChuYN-Strep
3.7 Activité enzymatique de la protéine ChuYN-StrepN-Strep
3.7.1 Réduction du tripyrrole par ChuYN-Strep
3.7.2 Détermination des constantes liées aux réactions
3.7.3 Dosage du fer libéré en solution
3.8 Caractérisation de la protéine ChuXN-Strep
3.8.1 Transfert de l’hème de la protéine ChuN-StrepX à ChuSN-His
3.8.2 Vitesse de transfert de l’hème
3.9 Réaction de dégradation de l’hème par ChuSN-His dans du tampon Tris-HCl
3.9.1 Réaction de la protéine ChuSN-His avec le peroxyde d’hydrogène dans du tampon Tris-HCl
3.9.2 Action de la protéine ChuYN-Strep
3.9.4 Détermination des constantes liées aux réactions
Chapitre 4 : Discussion
4.1 Clonage et expression des protéines
4.2 Purification des protéines
4.3 Reconstitution des protéines ChuX et ChuS avec de l’hème
4.3.1 Reconstitution de la protéine ChuX
4.3.2 Reconstitution de la protéine ChuS
4.4 Propriétés de la protéine ChuX
4.5 La protéine ChuY
4.6 La protéine ChuW
4.7 La protéine ChuS
4.8 Le regroupement de gènes chu
4.9 Perspectives
Conclusion
Bibliographie
Annexe